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貨號	FS-X9827

培養操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養板（每孔一片）或培養皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經過計數的細胞懸浮液移入培養板中，使蓋玻片*浸在培養液中；

5．將培養板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當貼壁細胞生長至覆蓋培養板底部2/3面積時，將培養板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及免疫細胞化學檢測。

中文名稱：Hoechst 33342/PI雙染試劑盒

英文名稱：Apoptotic Cell Hoechst 33342/PI Detection Kit

產品規格：100T

貨號：FS-X9827

產品介紹:

熒光染料Hoechst33342 能少許進入正常細胞膜，使其染上低藍色，而凋亡細胞的膜通透性增強，因此進入凋亡細胞中的Hoechst33342 比正常細胞的多，熒光強度要比正常細胞中要高，此外，凋亡細胞的染色體DNA 的結構發生了改變從而使該染料能更有效地與DNA 結合，并且凋亡細胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將Hoechst33342 排出到細胞外使之在細胞內積累增加等都使凋亡細胞的藍色熒光增強。而PI 染料是不能進入細胞膜完整的正常細胞和凋亡細胞中，即活細胞對PI 染料拒染，而壞死細胞由于膜完整性在早期即已破損，可被PI 染料染色。

用Hoechst33342 結合PI 染料對凋亡細胞進行雙染色，就可在流式細胞儀上將正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞區別開來。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，這三群細胞表現分別為：正常細胞為低藍色/低紅色（Hoechst33342+/PI+），凋亡細胞為高藍色/低紅色（Hoechst33342++/PI+），壞死細胞為低藍色/高紅色（Hoechst33342+/PI++）

儲存：2-8℃，避光，有效期一年。

實驗報告：

一、分離與培養：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸，接種于25cm2培養瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養箱中培養；

5、差速貼壁1h后，吸出培養基，按實驗需要接種于6孔板中繼續培養；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

Ⅱ型前膠原基端原肽(PⅡNT)英文名：PⅡNT 磷化熱休克蛋白β5/α晶狀體球蛋白B/αB-crystallin抗體包裝50mg

Ⅱ型膠原交聯羧基端肽(CTXⅡ)英文名：CTXⅡ 1號染色體開放閱讀框167抗體包裝1g

Ⅱ型膠原(COL2)英文名：COL2 1號染色體開放閱讀框168抗體包裝250mg

ⅡD組磷脂A2(PLA2G2D)英文名：PLA2G2D 1號染色體開放閱讀框170抗體包裝250mg

ⅡA組磷脂A2(PLA2G2A)英文名：PLA2G2A 1號染色體開放閱讀框172抗體包裝1g

Ⅰ型前膠原羧基端原肽(PⅠCP)英文名：PⅠCP 1號染色體開放閱讀框173抗體包裝5g

Ⅰ型前膠原基端原肽(PⅠNP)英文名：PⅠNP 1號染色體開放閱讀框174抗體包裝25g

Ⅰ型前膠原(PCⅠ)英文名：PCⅠ 1號染色體開放閱讀框177抗體包裝5g

Ⅰ型膠原交聯羧基端肽(CTXⅠ)英文名：CTXⅠ 1號染色體開放閱讀框180抗體包裝1g

Ⅰ型膠原交聯基端肽(NTXⅠ)英文名：NTXⅠ 1號染色體開放閱讀框182抗體包裝1g

Ⅰ型膠原α2(COL1α2)英文名：COL1α2 1號染色體開放閱讀框183抗體包裝25g

Ⅰ型膠原α1(COL1α1)英文名：COL1α1 1號染色體開放閱讀框187抗體包裝5g

Ⅰ型膠原(COL1)英文名：COL1 1號染色體開放閱讀框189抗體包裝5g

90kDa熱休克蛋白β1(HSP90β1)英文名：HSP90β1 1號染色體開放閱讀框190抗體包裝100ml

90kDa熱休克蛋白αA1(HSP90αA1)英文名：HSP90αA1 1號染色體開放閱讀框192抗體包裝25ml

輪枝菌Verticillium│sp. 質量規格：HPLC>98%,標準品乙肝表面抗原大蛋白試劑盒原花青B2;Procyanidin B

球孢白僵菌Beauveria│bassiana (Bals.-Criv.) Vuill. 質量規格：>98%,BR乙脫氫試劑盒原花青B1;Procyanidin B

鏈霉菌屬菌種Streptomyces│sp. 質量規格：HPLC>98%,標準品乙呋試劑盒乙酰紫堇靈;Acetylcorynoli
Hoechst 33342/PI雙染試劑盒 叔丁基二硫抗mannobioside糖抗體

亮白曲霉 2,2-二氟-3-羥基戊乙酯鋅-α2脂蛋白

烏克蘭毛霉 2-溴-3,4-二氟苯巖藻糖基化觸珠蛋白

短柄帚霉 6-甲基-3H-噻吩[2,3-d]嘧啶-4-酮膽固-25-羥化

鼠李糖乳桿磺酚S受體自身抗體

產氣腸桿* 3,5-二溴-2-吡受體

新疆鹽單胞 5-溴-4-甲基-1H-吲唑S轉移Mu1

禾谷鐮孢 2--3-氟-5-硝基吡啶乙酰CoA羧化

總狀共頭霉噻吩并[3,2-b]吡啶-7-蛋白激M2

大孢聯軛霉 5-溴吲唑-3-甲系統性紅斑狼瘡IgG

黑曲霉 2-乙硫基-5-硝基吡啶系統性紅斑狼瘡IgA

圍小叢殼 L-肌肽鋅系統性紅斑狼瘡IgM

蠟樣芽胞桿 4-苯氧基芐糖化血紅蛋白

博斯氏屬 2-叔丁苯纖維蛋白單體

葉球形微桿 4,6-二-2-甲氧基嘧啶酮激M2
操作規程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數目，需根據細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養箱培養24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)