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上海金穗生物科技有限公司
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使用*抗原來選擇gⅥ-CDNA噬菌體文庫

時間:2013-1-4閱讀:482
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[方法]
1.在2m1的PBS2M緩沖液中打散2mg*磁珠(200ul)并在室溫下旋轉機中孵育l小時,再用PBST沖洗磁珠3次。
2.將2.5×1012TU的cDNA噬菌體文庫(大概要準備250ml噬菌體文庫)和用250ul PBS4M打散后的1mg磁珠混合,然后在室溫旋轉機中孵育l小時,這一步要盡可能多地除去與*結合的噬菌體顆粒。
3.用收集器收集磁珠,將上清液轉移到新的微離心管中,加*誘餌(后濃度為250mmol/L)并在4℃旋轉機中孵育3小時。
4.加1mg磁珠(*步準備好的)到噬菌體+誘餌混合物中并在4℃旋轉機中孵育30分鐘。
5.用收集器收集磁珠,用PBST沖洗磁珠10次,根據收集器將微離心機設置為瞬時離心以維持磁珠在微離心管的底部。
6.(a)在0.5ml的PBS和50mmol/L的DTT溶液中打散磁珠以便抽提噬菌體顆粒,在室溫下孵育10分鐘,然后用收集器收集磁珠并將上清液轉移到一新的微離心管中,在冰浴中保存溶液。(b)另一方面,在400ul 0.1mol/L*—HCl,pH 2.2溶液中打散磁珠,再在室溫下孵育10分鐘,然后用收集器收集磁珠并將上清液轉移到一新的微離心管中,加100ul 1mol/LTris—HClpH 8.0的溶液來中和該溶液,后在冰浴中保存溶液。7.將一半抽提出來的噬菌體(250ul)加10ml平板*0F細胞中⑧,在37℃孵育30分鐘。
8.取一等份感受態培養細胞(100ul),連續稀釋然后將它們涂抹在LBAT平板上,37℃過夜孵育后計克隆數。
9.在20℃,2500g旋轉剩余的感受態培養細胞10分鐘,除去上清液,然后在LBAT溶液中打散細胞顆粒,每一平方平板涂抹1m1細胞懸浮液,在37℃過夜孵育平板。
10.獲得并儲存選擇出的克隆,如果還需做進一步的選擇,可以在裝有1 OD600細胞(8×108個細胞)的100m1搖瓶中接種20ml LBAT,并對噬菌體顆粒進行獲取和純化處理。

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