1 ．利用PCR從預制的丸GTll文庫中制備cDNA插入片段：pG6質粒是為帶有多聚T核苷酸的cDNA進行方向性克隆而設計的。利用帶有各自閱讀框的三個載體，每個cDNA都有可能被正確翻譯，直到核糖體遇到終止密碼子。考慮到許多蛋白分子的裝配，采用隨機引物法來構建cDNA文庫可能對克隆相互作用更適合。事實上，不是全長蛋白而是功能區(qū)，特別是細胞質的功能區(qū)對無毒性的及作為pⅥ融合的表達起著更重要的作用。然而，在理想條件下，在這些載體中對用隨機引物法構建的cDNA文庫進行克隆必須要求在每個載體的N021位點后，在每個閱讀框內有翻譯終止子的引導區(qū)。而且，只有50%的轉化子在正確的表達位點上包含了cDNA 片段。

利用PCR從已制備的cDNA文庫中制備大量的cDNA 片段，用來構建gⅥ-cDNA噬菌體顆粒文庫。盡管描述了從一個已制備的、SfiI-NotIλ入GTll方向性克隆的cDNA文庫中擴增的cDNA 片段，但是這更適合于從使用適當載體引物的其他文庫中擴增cDNA 片段，這個引物包含了酶SfiI和酶NotI的限制位點。建立一個大容量的gⅥ-cDNA文庫需要有十個同一的PCR反應。盡管提供一個特殊的方法很難，但從經驗上來說，哺乳動物的cDNA文庫由5×105～1×106個獨立的克隆組成，從系統(tǒng)學上說，這些克隆至少包含每個mRNA的一個拷貝。模板cDNA文庫應該如實地把序列、序列大小以及產生它的mRNA數(shù)量的復雜程度呈現(xiàn)出來，這是很重要的一面。為了增加DNA合成的保真度，我們*使用具有3’到5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶。

擴增的DNA純化后，用Sfi和NotI進行消化，除去小片段的cDNA，用0．8%（w/v）瓊脂糖凝膠電泳來分離消化的cDNA 片段。另一方面，這些短的片段選擇性地插入到文庫中，并減少文庫中長cDNA克隆基因的數(shù)量。從瓊脂糖薄片上純化DNA并借用商業(yè)可行的系統(tǒng)可以恢復和濃縮靶cDNA（大小在500～3000bp）。

2．連接與轉化：擴增的cDNA 片段連接到pG6質粒上，為了確定優(yōu)化條件，在腳注中描述了連接測試。另外，為了增加轉化效率，建議純化連接混合物。近年來，電轉化法是將質粒DNA轉化到大腸桿菌中有效的方法。

3．gⅥ-cDNA文庫的評價及保存
為了確保在eDNA文庫重建過程中篩選出來的陰性結果不是由技術失誤造成的，因此檢驗文庫的質量是十分有必要的，建議要決定好獨立文庫克隆的數(shù)量、片段基因克隆的比例、片段平均長度及它的長度范圍。更加嚴格的質量控制的方法是隨機抽取10個克隆，對每個cDNA片段從5’端至3’端測序，然后利用BLASTN數(shù)據(jù)庫來分析獲得的序列。