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上海紀寧實業有限公司
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ELISA試驗(細胞樣本)前處理

時間:2017-11-20閱讀:146
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我司全體ELISA試劑盒產品熾熱*,*,質量保證,產品買的多扣頭就多,另有禮品贈送。我司主營現貨產品有ELISA試劑盒、規范品、抗體、染色液、血清、細胞株、培育基等,訂貨!本公司產品僅用于科研運用,不供臨床實驗。
一、勻漿介質(量)
一般采用0.05mol/LTris-HCl,pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS),客戶可依據樣本及測定目標的狀況自行設定濃度,意圖是堅持樣本的等滲環境。
二、細胞樣本的前處理:
1、細胞沉積的搜集:
①懸浮細胞:關于懸浮培育的細胞,直接經過離心搜集細胞沉積,將培育液在室溫條件下1000轉/分,離心10分鐘,棄上清留細胞沉積。
②貼壁細胞:關于貼壁培育的細胞,用*將細胞消化下來,或用細胞刮將細胞刮下來,將培育液在室溫條件下1000轉/分,離心10分鐘,棄上清留細胞沉積。
我們一般主張客戶,細胞密度不要小于一百萬個/ml。
2、ELISA試劑盒細胞沉積的洗刷:
在細胞沉積中參加0.5-1ml的PBS(等滲),悄悄倒置混勻,將培育液在室溫條件下1000轉/分,離心10分鐘,棄上清留細胞沉積。重復上述操作重復洗刷1~2次。
3、勻漿的辦法:手藝勻漿,超聲破碎,裂解液裂解,重復凍融。
①手藝勻漿:在細胞沉積中參加必定量的PBS(PBS的參加量依據所測目標的不同而有所改動,一般參加0.5ml,細胞密度不小于一百萬個/ml),混勻,將細胞懸浮于PBS中,用移液器將細胞懸浮液移至玻璃勻漿管中(2ml玻璃勻漿管),將玻璃勻漿管置于冰水混合物中,手動勻漿3分鐘,然后取破碎好的細胞懸浮液進行測定。
②超聲破碎:
在細胞沉積中參加必定量的PBS(PBS的參加量依據所測目標的不同而有所改動,一般參加0.5ml,細胞密度不小于一百萬個/ml),混勻,將細胞懸浮于PBS中,在冰水浴條件下進行如下操作:
a、用超聲粉碎機進行粉碎,可用Soniprep150型超聲波發生器以振幅14微米超聲處理30秒使細胞破碎,也可用國產超聲波發生儀,用400安培,5秒/次,空隙10秒重復3~5次。
b、用超聲細胞破碎儀,300W功率,每次超聲3~5秒,間隔30秒,重復4~5次。
③裂解液裂解
常用裂解液有SDS、NP-40、TritonX-100,這三種去垢劑的效果是不同的,或者說效果力量強弱不同。
1、SDS歸于離子型去垢劑,zui厲害,根本能夠把細胞*破掉,DNA會釋放出來,裂解液變得很粘稠。
2、NP-40是很溫文的去垢劑,1%濃度的根本能夠損壞掉胞膜,而對核膜損壞的效果弱,結合特定的buffer能夠獲得胞漿蛋白。
3、TritonX-100的能力介于NP40和SDS之間,傾向于NP40,也是常用的細胞裂解液成分之一,在維護蛋白活性方面有必定效果(SDS根本會使蛋白變性失活)。
去垢劑特點僅僅一方面,buffer、配比、濃度、提取辦法和資料處理也都是關鍵因素
因為許多裂解液都是蛋白變性劑,對酶生機的測定有必定的影響,一般不引薦用裂解液進行裂解。
④重復凍融:
ELISA試劑盒在細胞沉積中參加必定量的PBS(PBS的參加量依據所測目標的不同而有所改動,一般參加0.5ml,細胞密度不小于一百萬個/ml),混勻,將細胞懸浮于PBS中,放低溫冰箱中結冰,溶解,再結冰,再溶解,重復3次左右)。因為重復凍融對酶生機影響較大,一般不引薦運用。

 

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