山羊源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒說明書

需要自備的器材：

1．方法儀器：分析天平、離心機(jī)、熒光 PCR 擴(kuò)增儀、組織研磨器、-20 ℃冰箱、可調(diào)移液器（2 µL、20

µL、200 µL、1000 µL）。

2．耗材：熒光 PCR 專用反應(yīng)管、眼科剪、眼科鑷、生理鹽水、1.5 mL 經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）水

處理的滅菌離心管、吸頭（10 µL、200 µL、1000 µL）、滅菌雙蒸水。

樣本采集、存放及運輸：

1、樣本采集：各類型樣本按照常規(guī)方法采集；

2、存放：樣本在2~8℃條件下保存應(yīng)不超過72h，-70℃以下可長期保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（zui多凍融3次）；

3、運輸：采用泡沫箱加冰密封進(jìn)行運輸。

組成及試劑配制:

1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）

2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

3、 樣品稀釋液：1×20ml。

4、 檢測稀釋液A：1×10ml。 

5、 檢測稀釋液B：1×10ml。   

技術(shù)原理：

DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。

       在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。（ DNA高溫變性低溫復(fù)性）

       發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。

特點優(yōu)勢：

    1.特異性：所有產(chǎn)品使用的引物均經(jīng)過詳盡的生物信息學(xué)分析，經(jīng)過GenBank及自建龐大數(shù)據(jù)庫的比對，確保所用的每一條引物均為種屬或血清型特異的基因序列區(qū)段，可實現(xiàn)對細(xì)菌種屬及血清型的特異檢測，特異性均達(dá)到100%。

    2.   重現(xiàn)性：該系列所有產(chǎn)品均經(jīng)過大量實驗菌株的驗證，重現(xiàn)性為100%。

    3.   靈敏性：該系列產(chǎn)品可實現(xiàn)對檢測菌的高靈敏檢測，當(dāng)樣品中細(xì)菌的濃度達(dá)到103cfu/ml時，可實現(xiàn)對其的直接檢測，無需繁瑣的增菌過程。

    4.   實用性：檢測范圍廣，涵蓋了對人體危害較為嚴(yán)重的17種呼吸道及腸道致病菌，可實現(xiàn)對臨床樣品及其他環(huán)境取樣的快速檢測，整個檢測過程為3-4個小時。

    5.   優(yōu)勢1：序列資源豐富，除GenBank公布的序列外，公司還進(jìn)行了大量菌株的序列破譯，從理論上保證所選引物具有良好的保守性和特異性。

    6.   優(yōu)勢2：該系列試劑盒均經(jīng)過大量的保守性及特異性實驗驗證，憑借公司擁有的豐富的菌種資源，每一種檢測試劑盒均經(jīng)過了20余種標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株的保守性驗證及40余種近緣標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株的特異性驗證，確保在使用過程中不會出現(xiàn)任何的假陽性及假陰性報告結(jié)果。

注意事項：    

1、使用本試劑前請仔細(xì)閱讀本說明書全文。

2 、操作時應(yīng)盡量少說話，因口腔中也含有支原體，可能引起樣品污染，而造成假陽性；整個檢測過程中，反應(yīng)體系的配制、樣本處理及加樣、PCR擴(kuò)增應(yīng)分區(qū)域進(jìn)行，以避免交叉污染。

3 、實驗時，試劑盒組分中的試劑使用前應(yīng)充分融化并混勻（混勻時禁止激烈振蕩，只需要進(jìn)行上下倒置多次進(jìn)行混勻）。

4、 反應(yīng)管中加好所有的試劑后，應(yīng)盡快上PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，以免形成過多的二聚體。 

5、細(xì)胞培養(yǎng)物中含有青霉素和鏈霉素等抗生物素不會影響本品的檢測結(jié)果。如果用戶需要進(jìn)一步提高檢測。