當前位置:上海邦景實業有限公司>>技術文章>>PCR反應液的污染消除方法
PCR是非常靈敏的一項檢測,100個拷貝之內的靶序列就足以產生陽性擴增,從而容易出現DNA污染導致的假陽性。首先,要辨別PCR污染的來源。設立陰陽性對照,有利于檢測反應體系各成分的污染情況。尤其是設立空白對照,即包括PCR的全部組分,而不加模板DNA,這對檢測試劑中PCR產物殘留污染是非常有益的。
在排除試劑污染的可能性外,更換試劑后,若不久又發現試劑被污染了,則考慮可能為環境污染。環境污染的最主要原因是DNA溶液的濺出和DNA氣溶膠造成的實驗區域的污染,這尤其在PCR產物擴增區容易出現。移液器槍頭和EP管架是也較常見的污染部位。
如果是環境污染,還可對每個區域進行涂抹采樣和核酸提取,以最終鑒定污染的區域所在。
對于PCR反應液的污染,可采取以下方法:
1、DNase I 法:
PCR混合液(未加模板和Taq聚合酶)加入0.5U DNase I,室溫反應30min后加熱滅活,然后加入模板和Taq聚合酶進行正常PCR擴增。
2.、內切酶法:
選擇識別4個堿基的內切酶(如MspI和TaqI等),可同時選擇幾種,以克服用一種酶只能識別特定序列的缺陷,室溫作用1h后加熱滅活進行PCR。
3、紫外照射法:
未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液進行紫外照射,注意事項與方法同上述UV照射法。
4、尿嘧ding 糖苷酶(UNG)法:
用dUTP代替dTTP,使PCR產物中摻入大量dU。在再次進行PCR擴增前,用UNG處理PCR混合液即可消除PCR產物的殘留污染。由于UNG在PCR循環中的變性一步便可被滅活,因此不會影響含dU的新的PCR產物。
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