在PCR自動熱循環中，最關鍵的因素是變性與退火的溫度。如操作范例所示，其變性、退火、延伸的條件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30個循環，擴增片段500bp。在這里，每一步的時間應從反應混合液達到所要求的溫度后開始計算。在自動熱循環儀內由混合液原溫度變至所要求溫度的時間需要30～60s，這一遲滯時間的長短取決于幾個因素，包括反應管類型、壁厚、反應混合液體積、熱源(水浴或加熱塊)以及兩步驟間的溫度差，在設置熱循環時應充分給以重視和考慮，對每一儀器 均應進行實測。

關于熱循環時間的另一個重要考慮是兩條引物 之間的距離;距離越遠，合成靶序列全長所需的時間也越長，前文給出的反應時間是按適于合成長度500bp的靶序列擬定的。下面就各種溫度的選擇作一介紹。

1.模板變性溫度
變性溫度是決定PCR反應中雙鏈DNA 解鏈的溫度，達不到變性溫度就不會產生單鏈DNA模板，PCR也就不會啟動。變性溫度低則變性不全，DNA雙鏈會很快復性，因而減少產量。一般取90～95℃。樣品一旦到達此溫度宜迅速冷卻到退火溫度。DNA變性只需要幾秒種，時間過久沒有必要;反之，在高溫時間應盡量縮短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高變性溫度不宜超過95℃。

2.引物退火溫度
退火溫度決定PCR特異性與產量;溫度高特異性強，但過高則引物不能與模板牢固結合，DNA擴增效率下降;溫度低產量高，但過低可造成引物與模板錯配，非特異性產物增加。一般先由37℃反應條件開始，設置一系列對照反應，以確定某一特定反應的最適退火溫度。也可根據引物的(G+C)%含量進行推測，把握試驗的起始點，一般試驗中退火溫度Ta(annealing temperature)比擴增引物的融解溫度TTm(melting temperature)低5℃，可按公式進行計算：

Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃

其中A，T，G，C分別表示相應堿基的個數。例如，20個堿基的引物，如果(G+C)%含量為50%時，則Ta的起點可設在55℃。在典型的引物濃度時(如0.2μmol/L),退火反應數秒即可完成，長時間退火沒有必要。