細胞培養操作規程：

一．培養基及培養凍存條件準備：

1）準備RPMI-1640培養基(RPMI-1640：GIBCO，貨號21875-091)，90%；優質胎牛血清，10%。

2）培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配，液氮儲存。

二．細胞處理：

1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養基的培養瓶中培養過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

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商品介紹：

使用方法：

收到細胞后，請按照以下方法進行操作。

1. 取出25cm2培養瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5% CO2細胞培養箱中靜置6-8小時或者過夜，以穩定細胞狀態。

2. 待細胞達到80%匯合時準備進行傳代培養。

3. 細胞傳代

1) 吸出25cm2培養瓶中的培養基，用PBS清洗細胞一次；

2) 添加0.125%消化液約1mL至培養瓶中，37℃溫浴3min左右；倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入*培養液終止消化；

3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當的比例進行接種傳代，然后補充新鮮的*培養基至5mL，放入37℃，5% CO2細胞培養箱中培養；

4) 待細胞*貼壁后，培養觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養基。

培養操作：

1）復蘇細胞：將含有 1mL 細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補 加 1-2mL 培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培 養過夜（或將 細胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養基，培養過夜）。第二天換液并 檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達 80%-90%，即可進行傳代培養。

1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細胞 1-2 次。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于 37℃培 養箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分 變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養 瓶后加少量培養基終止消 化。

3. 按 6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘，棄去上清液，補加 1-2mL 培養液后吹勻。

4. 將細胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養基的新皿中或者瓶中。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為類；

1. 細胞凍存時，棄去培養基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml ，細胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養基終止消化，可使用血球計數板計數。

2. 4 min 1000rpm 離心去掉上清。加 1ml 血清重懸細胞，根據細胞數量加 入血 清和 DMSO，輕輕混勻，DMSO 終濃度為 10%，細胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存 1ml 細胞懸液，注意凍 存管做好標識。

3. 將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80 度冰箱，2 個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。

人 CD157 人細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

人 CA14 人細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

小鼠 TNFRSF17 人細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

小鼠 B7-H2 / CD275 人細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

人 ASAM 人細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

小鼠 ASAH2 人細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

小鼠 ALK-3 / BMPR1A 人細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

人 ADAM15 / MDC15 人細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

人 ACP5 /ows\system32\EhStorShell.dll

小膠質細胞：HMC3 eIF4E  真核翻譯起始因子4E抗體 規格: 0.1ml

Phospho-Tyrosine Hydroxylase (Ser40)  磷酸化羥化抗體 規格: 0.1mlRNF41  環指蛋白41抗體 規格: 0.2ml

FAM96B  FAM96B蛋白抗體 規格: 0.2mlIGFBP1  胰島素樣生因子結合蛋白1抗體 規格: 0.1ml

PDLIM1  細胞骨架蛋白C端PDLIM1抗體 規格: 0.2ml

2 ug pLVX-shRNA1 pLVX-shRNA1 低溫運輸，-20℃保存

MAPK13/SAPK4/p38delta  絲裂原活化蛋白激13抗體 規格: 0.2ml

300U TEV蛋白 TEV Protease -20℃保存

Rabbit anti-mouse Kappa light chain/APC  APC標記的兔抗小鼠k鏈 規格: 0.1mlHistone H3 (Tri Methyl K4)  三甲基化組蛋白H3抗體 0.1ml

克氏檸檬酸鹽培養基  250g

SLC14A1/RACH1  尿素轉運型糖蛋白抗體 規格: 0.2ml

500mL Sodium Phosphate Buffer（鈉緩沖液）,0.2M,pH8.5  Sodium Phosphate Buffer,0.2M,pH8.5  常溫保存

50uL 電泳級耐熱型SYBR染料 SuperSYBR，EG 常溫閉光