SHG-44細胞的轉染操作方法

(1) 轉染當天，加入脂質體/ DNA混合物之前的短時間內，更換1ml新鮮的有血清或無血清培養基。

(2) 準備不同比例的DOSPER/ DNA混合物，以確定每個細胞系的比例。① 溶液A：用HBS稀釋DNA(pcDNA3、重組pcDNA3)各1.5μg 到總體積50μl(30μg/ml)。②溶液B：用HBS稀釋6μl脂質體到終容積50μl(120μg/ml)。③混合溶液A和B，輕柔混合(不要振蕩)，室溫孵育15min，以便脂質體/DNA混合物形成。

(3) 不要移去培養基，逐滴加入100μl 脂質體/DNA混合物(從培養孔一邊到另一邊)，邊加邊輕搖培養板。

(4) 37℃孵育6hr。

(5) 6hr后更換轉染培養基，加入2-3ml新鮮生長培養基。

(6) 轉染24hr后施加篩選壓力，改用含G418的培養基培養。

4、 G418篩選：在G418篩選濃度下持續培養14天后，挑出單克隆，擴大培養，同時轉染pcDNA3即SHG-44-vect，并設對照組細胞系即SHG-44。

篩選結果鑒定：

(1)基因組DNA提取→PCR鑒定外源基因

(2)SHG-44-重組pcDNA3陽性細胞、SHG-44-vect裂解→聚丙烯酰胺凝膠電泳→免疫印跡鑒定P16蛋白表達(Western-blot)。

(3)測定外源性基因對SHG-44細胞增殖的影響

①流式細胞儀分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3→單細胞懸液→70%酒精固定→裂解細胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上機分析G1期和G2/M、S期比例。

②細胞生長曲線測定：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3→5×104/孔接種24孔培養板→24hr后各自用苔盼藍染色計數細胞→計算細胞生長抑制百分率。

③軟瓊脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3→104 細胞→0.3%低熔點瓊脂糖培養→1-2周后計數不可少于50個細胞的克隆數→計算克隆形成率抑制率。

注意事項

1、優化轉染條件(脂質體的用量、DNA密度、細胞密度、脂質體和DNA混合孵育時間)每種細胞和質粒均須進行。用于轉染的核酸應高度純化。為避免微生物污染，所用溶液濾過滅菌，以及隨后的使用應在無菌條件下，這是細胞慣常的做法。但是，脂質體以及脂質體/ DNA混合物無需濾過除菌。

2、預備脂質體/DNA混合物必須在無血清下進行。但是在隨后的脂質體/ DNA與被轉染細胞共孵育的過程中，血清又是培養基的一部分。

3、細胞系在轉染之前更換培養基，可提高轉染效率，但所用培養基必須37℃預溫。

脂質體/ DNA混合物應當逐滴加入，盡可能保持一致，從培養皿一邊到另一邊，邊加入邊輕搖培養皿，以確保均勻分布和避免局部高濃度。