蕎麥源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒通用原則:

1, 先選擇好探針,然后設(shè)計(jì)引物使其盡可能的靠近于探針。

2, 擴(kuò)增子的長(zhǎng)度應(yīng)不超過400bp,理想的*能在100-150bp內(nèi),擴(kuò)增片斷約短,有效的擴(kuò)增反應(yīng)就越容易獲得。較短的擴(kuò)增片斷也容易保證分析的一致性

3, 保持GC含量在20%和80%之間,GC富含區(qū)容易產(chǎn)生非特異反應(yīng),從而會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增效率的降低,及在SG分析中非特異信號(hào)。

4, 為了保證效率和重復(fù)性,應(yīng)避免重復(fù)的核苷酸序列,尤其是G(不能有4個(gè)連續(xù)的G)

5, 將引物和探針互相進(jìn)行配對(duì)檢測(cè),以避免二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成。

b),探針設(shè)計(jì)指導(dǎo)

1,在設(shè)計(jì)引物之前設(shè)計(jì)探針

2,探針的Tm值應(yīng)在68-70℃之間,如果是目測(cè)探針,則要仔細(xì)審查GC富含區(qū)。

3,探針的5’端要避免有鳥an酸,5’G會(huì)有淬滅作用,即使被切割下來這種淬滅作用也還會(huì)存在

4,選擇C多于G的鏈作探針,G的含量多于C會(huì)降低反應(yīng)效率,這時(shí)就應(yīng)選擇配對(duì)的另一條鏈作為探針。

6, 探針應(yīng)盡可能的短,不要超過30個(gè)bp。

7, 檢測(cè)探針的DNA折疊和二級(jí)結(jié)構(gòu)。

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6-10B, 人鼻咽癌細(xì)胞系

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