ATCC細(xì)胞將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 MC3T3-E1細(xì)胞以1×106 /皿接種于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿(Nunc)中, 用*培養(yǎng)基(α-MEM基本培養(yǎng)基添加 10% FBS), 在37 °C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后, 更換為成骨分化培養(yǎng)基(α-MEM基本培養(yǎng)基, 添加 10% FBS、50 μg/mL抗壞血酸和10 mmol/L β-甘油磷酸鈉)誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化(0 d), 并分別在誘導(dǎo)分化 4 d(分化中期)或7 d(礦化起始期)時(shí), 將細(xì)胞分為4組: 即對(duì)照組(C)、μ g組、1 g組和2 g組, 繼續(xù)培養(yǎng)12 h后, 收集細(xì)胞樣品用于后續(xù)檢測(cè)。

 對(duì)硝基苯磷酸(p-nitrophenyl phosphate, pNPP) 法檢測(cè)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性

MC3T3-E1經(jīng)誘導(dǎo)成骨分化4 d或7 d后, 分別在對(duì)照、μ g、1 g和2 g環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)12 h后, 采用pNPP法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ALP活性。從不同環(huán)境中取出細(xì)胞, 去掉培養(yǎng)基, 經(jīng)PBS清洗后, 向每皿中加入1 mL 0.5% Triton X-100, 放入–80 °C, 反復(fù)凍融3次后, 將細(xì)胞裂解液吸入1.5 mL Eppendorf管中, 15 000 g, 4 °C離心5 min, 吸取上清, 采用Alkaline Phosphatase Yellow (pNPP) Liquid Substrate System for ELISA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ALP活性, 分別在反應(yīng)0 min 與10 min時(shí)在405 nm讀數(shù), 以10 min讀數(shù)減去0 min 讀數(shù)來(lái)分析ALP活性, 同時(shí), 采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。ALP活性以蛋白含量做歸一化處理后以對(duì)照組為參照用百分比表示。

茜素紅S染色檢測(cè)礦化結(jié)節(jié)

 MC3T3-E1經(jīng)誘導(dǎo)成骨分化7 d后, 分別在4種不同環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)12 h后, 從不同環(huán)境中取出細(xì)胞, 去掉培養(yǎng)基, 經(jīng) PBS清洗后, 向每皿中加入2 mL 10%中性甲醛, 固定細(xì)胞15 min, PBS清洗, ATCC細(xì)胞每皿加入1 mL 0.5%茜素紅S染色15 min, 用自來(lái)水在搖床上搖動(dòng)清洗4次, 每次5 min。采用掃描儀對(duì)著色的礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行掃描, 并采用Image J軟件(National Institutes of Health, NIH)對(duì)礦化結(jié)節(jié)面積進(jìn)行分析。
 PTP-1B蛋白IgG     磷酸化活化復(fù)制因子2    小鼠少突膠質(zhì)髓鞘糖蛋白(OMgp-Ab) 
 P-鈣粘附分子IgG     磷酸化活化復(fù)制因子2    小鼠少突膠質(zhì)髓鞘糖蛋白(OMgp-Ab) 
 P物質(zhì)IgG     活化轉(zhuǎn)錄因子3    小鼠上皮中性?；罨?8(ENA-78/CXCL5)
 P物質(zhì)受體IgG     自噬相關(guān)蛋白1    小鼠色素上皮衍生因子(PEDF)
 P選擇素IgG     磷酸化自噬相關(guān)蛋白1    小鼠色素C(Cyt-C)
 Rad51IgG     自噬相關(guān)蛋白7    小鼠三碘甲狀腺原氨酸(T3)
 Raf激酶抑制蛋白IgG     G1氨基丁酸A型受體相似蛋白2    小鼠乳鐵傳遞蛋白/乳鐵蛋白(LF/LTF)
ATCC細(xì)胞