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參數規格：

產品名稱：轉基因品系大豆A5547-127探針法qPCR試劑盒
貨號:CP96954
產品規格：50T
產品運輸：低溫運輸
產品保存：-20℃保存
產品有效期：一年
運輸：低溫
注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時間；4．循環次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術的基本原理；7．PCR的反應動力學；8．PCR擴增產物；9．PCR反應體系與反應條件。

實驗方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl     dNTP mix （2mM）
4 μl     引物1（10pM）
2 μl     引物2（10pM）
2 μl     Taq酶（2U/μl）
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl      加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2：調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環30-35次，在72℃ 保溫7min。
3：結束反應，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4：PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μl進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
使用方法:
一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。
1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，*用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 陽性對照（濃度為 1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
7. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產品跟市場上絕大多數核酸純化產品兼容。
8. 如果有 N 個樣品，則需要進行 N+2 個樣品提取，多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。
三、設置 qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于PCR 陽性對照。
PCR檢測方法包括以下步驟：
(1)將參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個質粒載體上，構建一種可同時用于參照基因以及待測目的基因擴增檢測的標準品，并將所得標準品按照濃度梯度稀釋后同時用于繪制參照基因以及待測目的基因的標準曲線；
(2)待測樣本與步驟(1)所述標準品經同步進行實時熒光定量PCR擴增后，目的基因與參照基因按照各自的標準曲線計算各自的拷貝數，計算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數比值，即得目的基因的拷貝數相對定量檢測結果。
其中步驟(1)為：將參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個質粒載體上，構建一種可同時用于參照基因以及待測目的基因擴增檢測的標準品，并將所得標準品按照濃度梯度稀釋后同時用于繪制參照基因以及待測目的基因的標準曲線。
其中所述參照基因為本領域常規參照基因，較佳地管家基因，優選地為RPPH1的擴增區域，其中所述質粒載體為本領域常規質粒載體，較佳地為PCR克隆載體，優選地為TA cloning載體，所述TA cloning載體較佳地為pMD18-T載體。其中所述標準品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。所述的等比例較佳地為1：1。由于標準品中待測目的基因與參照基因的比例為1:1，解決了目前相對標準曲線法應用中目的基因與參照基因的濃度比例關系難以控制的問題，提高HER2基因擴增檢測的可靠性。
步驟(2)為：待測樣本與步驟(1)所述標準品經同步進行實時熒光定量PCR擴增后，目的基因與參照基因按照各自的標準曲線計算各自的拷貝數，計算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數比值，即得目的基因的拷貝數相對定量檢測結果。
其中所述待測目的基因為本領域常規待測目的基因，較佳地為腫瘤或者疾病的特異性基因，更佳地為HER2基因的擴增區域，所述熒光定量PCR擴增為本領域常規熒光定量PCR擴增方法，所述熒光定量PCR擴增方法較佳地為多通道熒光定量PCR擴增，更佳地為雙通道熒光定量PCR擴增。

以下是轉基因品系大豆A5547-127探針法qPCR試劑盒公司正在熱銷的產品：
Human RSPO1(R-spondin-1) ELISA Kit資源名稱貪銅菌種屬:Cupriavidus│basilensis分離基物:laboratory fixed-bed reactor

Human RUVBL1(RuvB-like 1) ELISA Kit資源名稱全食副球菌種屬:Paracoccus│pantotrophus提供形式:凍干物

Human SAE1(SUMO-activating enzyme subunit 1) ELISA Kit資源名稱產酶溶桿菌產酶亞種種屬:Lysobacter enzymogenes subsp. enzymogenes分離基物:土壤

Human SIVA1(Apoptosis regulatory protein Siva) ELISA Kit資源名稱生脂固氮螺菌種屬:Azospirillum│lipoferum提供形式:凍干物

Human SMC4(Structural maintenance of chromosomes protein 4) ELISA Kit資源名稱保加利亞乳桿菌種屬:Lactobacillus│bulgaricus提供形式:凍干物

Human SIK2(Serine/threonine-protein kinase SIK2) ELISA Kit資源名稱褐色綠僵菌種屬:Metarhizium│brunneum提供形式:斜面培養物

Human SORBS1(Sorbin and SH3 domain-containing protein 1) ELISA Kit資源名稱桑格利娜氏鏈霉菌種屬:Streptomyces│sanglieri提供形式:斜面培養物

Human SPOCK2(Testican-2) ELISA Kit資源名稱葡萄牙鏈霉菌種屬:Streptomyces│lusitanus提供形式:斜面培養物

Human ST6GAL1(Beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase 1) ELISA Kit資源名稱微紅黃色粘球菌(橙色粘球菌)種屬:Myxococcus│fulvus提供形式:斜面培養物

Human SWAP70(Switch-associated protein 70) ELISA Kit資源名稱高溫單孢菌種屬:Thermomonspora│sp.提供形式:斜面培養物

Human TARBP2(RISC-loading complex subunit TARBP2) ELISA Kit資源名稱淡色叢赤殼（斜面）種屬:Bionectria ochroleuca提供形式:斜面培養物

Human TBC1D1(TBC1 domain family member 1) ELISA Kit資源名稱榆干側耳種屬:Pleurotus│ulmarius提供形式:斜面培養物

Human TBPL1(TATA box-binding protein-like protein 1) ELISA Kit資源名稱綿皮臥孔菌種屬:Poria│sp.提供形式:斜面培養物

Human DRAM1(DNA damage-regulated autophagy modulator protein 1) ELISA Kit資源名稱密環菌種屬:Armillariella│mellea提供形式:斜面培養物

Human MBOAT4(Ghrelin O-acyltransferase) ELISA Kit資源名稱嗜金屬熱厭氧桿菌（00開頭的農業均無法提供）種屬:Thermoanaerobacter│siderophilus分離基物:油田采出水

Human LRP5(Low-density lipoprotein receptor-related protein 5) ELISA Kit資源名稱皮爾瑞俄類芽孢桿菌種屬:Paenibacillus│peoriae分離基物:土壤樣品

Human ATP13A2(Probable cation-transporting ATPase 13A2) ELISA Kit資源名稱飼料類芽胞桿菌種屬:Paenibacillus│pabuli分離基物:石油污染土

Human DNAJC27(DnaJ homolog subfamily C member 27) ELISA Kit資源名稱壁畫枝芽胞桿菌種屬:Virgibacillus│picturae分離基物:土壤樣品

Human MSMB(Beta-microseminoprotein) ELISA Kit資源名稱戈氏紅球菌種屬:Rhodococcus│gordoniae分離基物:土壤

Human RSAD2(Radical S-adenosyl methionine domain-containing protein 2) ELISA Kit資源名稱食微囊藻素鞘氨醇胞菌種屬:Sphingosinicella│microcystinivorans分離基物:土壤
轉基因品系大豆A5547-127探針法qPCR試劑盒GDF11(Growth Differentiation Factor 11)|BMP?11|GDF-11形態特性圓形生長特性貼壁生長特征特性該細胞是采用慢病毒感染的方式使MKN45細胞穩定表達Cas9-Flag-Neo，經400ug/mlG418篩選得到的單克隆，經Western Blotting驗證該克隆可以表達Cas9蛋白，可直接用Crispr技術編輯基因組DNA。培養條件 RPMI 1640 (w/o Hepes) 20%FBS；400ug/ml G418　

FABP5(Fatty Acid Binding Protein 5|Epidermal )|E?FABP|EFABP|fatty acid binding protein 5(psoriasis-associated)|Fatty acid-binding protein 5|PA-FABPepidermal|Psoriasis-associated fatty acid-binding protein homolog形態特性上皮樣生長特性貼壁生長　特征特性該細胞是采用慢病毒感染的方式使Hela細胞穩定表達Cas9-Flag-Neo，經400ug/mlG418篩選得到的單克隆，經Western Blotting驗證該克隆可以表達Cas9蛋白，可直接用Crispr技術編輯基因組DNA。培養條件 RPMI 1640 (w/o Hepes) 10%FBS；400ug/ml G418　

PFN2|Profilin-2|Profilin II形態特性上皮樣生長特性貼壁生長　特征特性該細胞是采用慢病毒感染的方式使Hela細胞穩定表達Cas9-Flag-Neo，經400ug/mlG418篩選得到的單克隆，經Western Blotting驗證該克隆可以表達Cas9蛋白，可直接用Crispr技術編輯基因組DNA。培養條件 RPMI 1640 (w/o Hepes) 10%FBS；400ug/ml G418　

NDN|Necdin形態特性上皮樣生長特性貼壁生長　特征特性該細胞是采用慢病毒感染的方式使Hela細胞穩定表達Cas9-Flag-Neo，經400ug/mlG418篩選得到的單克隆，經Western Blotting驗證該克隆可以表達Cas9蛋白，可直接用Crispr技術編輯基因組DNA。培養條件 RPMI 1640 (w/o Hepes) 10%FBS；400ug/ml G418　

HNRNPK|HNRPK|Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K|Transformation up-regulated nuclear protein|TUNP形態特性上皮樣生長特性貼壁生長　特征特性該細胞是采用慢病毒感染的方式使Hela細胞穩定表達Cas9-Flag-Neo，經400ug/mlG418篩選得到的單克隆，經Western Blotting驗證該克隆可以表達Cas9蛋白，可直接用Crispr技術編輯基因組DNA。培養條件 RPMI 1640 (w/o Hepes) 10%FBS；400ug/ml G418　

DEFB1|Beta-defensin 1|BD1|HBD1|BD-1|hBD-1|Defensin Beta 1形態特性上皮樣生長特性貼壁生長　特征特性該細胞是采用慢病毒感染的方式使Hela細胞穩定表達Cas9-Flag-Neo，經400ug/mlG418篩選得到的單克隆，經Western Blotting驗證該克隆可以表達Cas9蛋白，可直接用Crispr技術編輯基因組DNA。培養條件 RPMI 1640 (w/o Hepes) 10%FBS；400ug/ml G418　