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參數規格：

產品名稱：玉米內標準zSSIIb基因探針法PCR試劑盒
貨號:CP96942
產品規格：50T
產品運輸：低溫運輸
產品保存：-20℃保存
產品有效期：一年
運輸：低溫
注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時間；4．循環次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術的基本原理；7．PCR的反應動力學；8．PCR擴增產物；9．PCR反應體系與反應條件。

實驗方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl     dNTP mix （2mM）
4 μl     引物1（10pM）
2 μl     引物2（10pM）
2 μl     Taq酶（2U/μl）
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl      加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2：調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環30-35次，在72℃ 保溫7min。
3：結束反應，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4：PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μl進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
使用方法:
一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。
1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，*用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 陽性對照（濃度為 1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
7. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產品跟市場上絕大多數核酸純化產品兼容。
8. 如果有 N 個樣品，則需要進行 N+2 個樣品提取，多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。
三、設置 qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于PCR 陽性對照。
PCR檢測方法包括以下步驟：
(1)將參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個質粒載體上，構建一種可同時用于參照基因以及待測目的基因擴增檢測的標準品，并將所得標準品按照濃度梯度稀釋后同時用于繪制參照基因以及待測目的基因的標準曲線；
(2)待測樣本與步驟(1)所述標準品經同步進行實時熒光定量PCR擴增后，目的基因與參照基因按照各自的標準曲線計算各自的拷貝數，計算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數比值，即得目的基因的拷貝數相對定量檢測結果。
其中步驟(1)為：將參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個質粒載體上，構建一種可同時用于參照基因以及待測目的基因擴增檢測的標準品，并將所得標準品按照濃度梯度稀釋后同時用于繪制參照基因以及待測目的基因的標準曲線。
其中所述參照基因為本領域常規參照基因，較佳地管家基因，優選地為RPPH1的擴增區域，其中所述質粒載體為本領域常規質粒載體，較佳地為PCR克隆載體，優選地為TA cloning載體，所述TA cloning載體較佳地為pMD18-T載體。其中所述標準品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。所述的等比例較佳地為1：1。由于標準品中待測目的基因與參照基因的比例為1:1，解決了目前相對標準曲線法應用中目的基因與參照基因的濃度比例關系難以控制的問題，提高HER2基因擴增檢測的可靠性。
步驟(2)為：待測樣本與步驟(1)所述標準品經同步進行實時熒光定量PCR擴增后，目的基因與參照基因按照各自的標準曲線計算各自的拷貝數，計算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數比值，即得目的基因的拷貝數相對定量檢測結果。
其中所述待測目的基因為本領域常規待測目的基因，較佳地為腫瘤或者疾病的特異性基因，更佳地為HER2基因的擴增區域，所述熒光定量PCR擴增為本領域常規熒光定量PCR擴增方法，所述熒光定量PCR擴增方法較佳地為多通道熒光定量PCR擴增，更佳地為雙通道熒光定量PCR擴增。

以下是玉米內標準zSSIIb基因探針法PCR試劑盒公司正在熱銷的產品：
Human SRD5A1(3-oxo-5-alpha-steroid 4-dehydrogenase 1) ELISA Kit資源名稱煙色曲霉種屬:Aspergillus│fumigatus Fresen.分離基物:洋玉蘭落葉葉片

Human ADAMTS20(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 20) ELISA Kit資源名稱暗孢節菱孢種屬:Arthrinium│phaeospermum (Corda) M.B. Ellis分離基物:枯死竹子

Human POU5F1(POU domain, class 5, transcription factor 1) ELISA Kit資源名稱直立枝孢種屬:Acremonium│strictum W. Gams分離基物:洋玉蘭落葉葉片

Human NLRC4(NLR family CARD domain-containing protein 4) ELISA Kit資源名稱蘋果黑腐皮殼種屬:Valsa│mali Migabe & G. Yamada分離基物:蘋果

Human AQP-12A(Aquaporin-12A) ELISA Kit資源名稱壞損假尾孢種屬:Pseudocercospora│destructiva (Ravenel) Y.L. Guo & X.J. Liu分離基物:大葉黃楊葉片

Human ZMAT3(Zinc finger matrin-type protein 3) ELISA Kit資源名稱圍小叢殼菌種屬:Glomerella│cingulata (Stoneman) Spauld. & H. Schrenk分離基物:木欖

Human CTH(Cystathionine gamma-lyase) ELISA Kit資源名稱山楊黑星孢種屬:Fusicladium│tremulae分離基物:楊樹葉片

Human LIN28A(Protein lin-28 homolog A) ELISA Kit資源名稱殼菌種屬:Dothiorella│sp.分離基物:枝干

Human HSPA5(78 kDa glucose-regulated protein) ELISA Kit資源名稱殼皮炭疽菌種屬:Colletotrichum│crassipes (Speg.) Arx分離基物:葉片

Human MRC1(Macrophage mannose receptor 1) ELISA Kit資源名稱雜色尾孢種屬:Cercospora│variicolor G. Winter分離基物:牡丹葉片

Human ZFAND6(AN1-type zinc finger protein 6) ELISA Kit資源名稱貝倫格葡萄座腔菌種屬:Botryosphaeria│ribis Grossenb. & Duggar分離基物:蘋果枝干

Human MACC1(Metastasis-associated in colon cancer protein 1) ELISA Kit資源名稱北方蜜環菌種屬:Armillaria│borealis Marxm. & Korhonen分離基物:樺樹

Human IDO1(Indoleamine 2,3-dioxygenase 1) ELISA Kit資源名稱粉紅聚端孢霉種屬:Trichothecium│roseum (Pers.) Link分離基物:刺玫葉部

Human DNTT(DNA nucleotidylexotransferase) ELISA Kit資源名稱長極鏈格孢種屬:Prathoda│longissima (Deighton & MacGarvie) E.G. Simmons分離基物:玉米葉部

Human DUT(Deoxyuridine 5'-triphosphate nucleotidohydrolase, mitochondrial) ELISA Kit資源名稱小馬勃種屬:Lycoperdon│pusillum Batsch提供形式:斜面培養物

Human RAG1(V(D)J recombination-activating protein 1) ELISA Kit資源名稱純白環菇種屬:Leucoagaricus│leucothites (Vittad.) Wasser提供形式:斜面培養物

Human RAG2(V(D)J recombination-activating protein 2) ELISA Kit資源名稱瓜鏈格孢種屬:Alternaria│cucumerina (Ellis & Everh.) J.A. Elliott分離基物:黃瓜葉部

Human RPTOR(Regulatory-associated protein of mTOR) ELISA Kit資源名稱簇生鏈格孢種屬:Alternaria│alternata (Fr.) Keissl.分離基物:菜豆葉部

Human NARG2(NMDA receptor-regulated protein 2) ELISA Kit資源名稱煙色煙管菌種屬:Bjerkandera│fumosa (Pers.) P. Karst.分離基物:闊葉樹樹枝

BMP-6|BMP6|VGR|VGR1|Vgr-1|bone morphogenetic protein 6|vegetal related growth factor(TGFB-related)|vegetal-related(TGFB related) cytokine|VG-1-R|VG-1-related protein|Vg1-related sequence形態特性淋巴母細胞樣生長特性懸浮生長特征特性該細胞系來源于一無精癥男性患者的外周血。2009年由中科院昆明細胞庫通過EB病毒轉化的方法建立。培養條件 RPMI 1640 (w/o Hepes) 15%NBS

CD44|ECMR-III|HCAM|HCELL|LHR|MDU2|MDU3|MIC4|MUTCH-I|Pgp1|CD44R|CDw44|CSPG8|Epican|HUTCH-I|Hyaluronate receptor|IN|LHR|MC56|PGP-1|PGP-I|Phagocytic glycoprotein 1|Phagocytic glycoprotein I|IN形態特性淋巴母細胞樣生長特性懸浮生長特征特性該細胞系來源于一重度少精癥男性患者的外周血。2009年由中科院昆明細胞庫通過EB病毒轉化的方法建立。培養條件 RPMI 1640 (w/o Hepes) 15%NBS

C7(Complement component C7)形態特性淋巴母細胞樣生長特性懸浮生長特征特性該細胞系來源于一無精癥男性患者的外周血。2009年由中科院昆明細胞庫通過EB病毒轉化的方法建立。培養條件 RPMI 1640 (w/o Hepes) 15%NBS

Bcl-2|apoptosis regulator Bcl-2|B-cell CLL|lymphoma 2形態特性淋巴母細胞樣生長特性懸浮生長特征特性該細胞系來源于一無精癥男性患者的外周血。2009年由中科院昆明細胞庫通過EB病毒轉化的方法建立。培養條件 RPMI 1640 (w/o Hepes) 15%NBS

LP-a|LPA|Lp(a)|AK38|APOA|LP形態特性淋巴母細胞樣生長特性懸浮生長特征特性該細胞系來源于一重度少精癥男性患者的外周血。2009年由中科院昆明細胞庫通過EB病毒轉化的方法建立。培養條件 RPMI 1640 (w/o Hepes) 15%NBS