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上海莼試生物技術有限公司
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細胞培養(yǎng)克隆的制備

時間:2017-8-11閱讀:208
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細胞培養(yǎng)克隆,是將一個單細胞從細胞群中分離出來單獨培養(yǎng),使之重新繁衍成一個新的單一細胞群的培養(yǎng)技術。未經(jīng)克隆化的細胞具有異質(zhì)性,經(jīng)過克隆得到的是均一細胞集團。這里僅介紹T細胞與NK 細胞的克隆方法。
基本原理
用限度稀釋克隆形成法制備T 細胞克隆時,并非依賴細胞 的特性,而是將T 細胞在細胞培養(yǎng)板上稀釋到統(tǒng)計學的濃度,即從理論值上達到每孔1 個細胞,其中加入IL-2 和PHA 可增強細胞的生長,而加入的同種異體PBMC 作為飼養(yǎng)細胞,在這種體系中,單個T 細胞可增殖生長成細胞集團,即T 細胞克隆。
試劑和材料
●提純T 細胞(參見*章之第六節(jié))
● 飼養(yǎng)細胞(以50GYγ射線照射):從兩個不同供者獲得的同種異體PBMC從理論上認為兩者的每一演變均不同。
● 培養(yǎng)基:RPMI1640 培養(yǎng)液(RPMI1640 液+1mmol/L 丙酮酸鈉+2mmol/L *+100u/ml*和100μg/ml *)再加入熱滅活的10%的AB 型血清。
● 按說明書所述,將PHA-A 溶于雙蒸水中。
● 含有104u/ml hrIL-2 的PBS 液中加入1%牛血清白蛋白(BSA)。
● 器皿、儀器:96 孔U 型低細胞培養(yǎng)板及24 孔細胞培養(yǎng)板,垂直氣流超凈臺,CO2 孵箱,倒置顯微鏡等。
實驗操作
1.培養(yǎng)板的準備
T 細胞克隆的制備1) 應用典型的有限稀釋克
隆形成法,以0.5 個/孔、1 個/孔、5 個/孔等三種不同細胞濃度準備三塊96 孔U 型培養(yǎng)板,以及半塊
為10 個/孔濃度的96 孔培養(yǎng)板。
2) 準備含有5×105/ml 飼養(yǎng)細胞(經(jīng)γ射線照射)的RPMI1640培養(yǎng)液,并加入20u/ml 的IL-2 和1μg/ml PHA-A。
3) 在3 塊半96 孔板上,每孔均加入100μl 飼養(yǎng)細胞(50000個)。
4) 準備稀釋T 細胞的培養(yǎng)(圖2-3)
5) 如圖2-3 所示,準備3 支15ml 試管,內(nèi)含5ml 細胞培養(yǎng)液(CM)加20u/ml IL-2,將4 支試管分別稀釋并接種96 孔板,步驟如下:
(1) 第1 管加50μl 稀釋液C,相當50 個細胞,混勻后加在96 孔板上,50μl/孔,此板為0.5 細胞/孔。
(2) 第2 管加100μl 稀釋液C,相當100 個細胞,混勻后加在96 孔板上,50μl/孔,此板為1 細胞/孔。
(3) 第3、4 管各加500μl 稀釋液C,相當500 個細胞,第3 管為500 細胞/5mlCM,,混勻后加在96 孔板上,50μl/孔,此板為5 細胞/孔; 第4 管為500 細胞/2.5mlCM,,混勻后僅夠加半個板,50μl/孔,此板為10 個細胞/孔。
4 塊96 孔板上有50μl 不同濃度T 細胞懸液加到含有100μl 飼養(yǎng)細胞的各孔中(IL-2 的終濃度應為20u/ml)。
T 細胞克隆的制備2.T細胞克隆培養(yǎng)
1) 如圖2-4 所示,每隔2-3 天吸棄50μl培養(yǎng)上清液,加入50μl 含有IL-2 的新鮮培養(yǎng)液,使其終濃度達20u/ml;每隔10-15 天吸棄50μl 培養(yǎng)上清液,加入50μl 含有新鮮飼養(yǎng)細胞(50000/孔)、IL-2(終濃度達20u/ml)和PHA-A(終濃度達1μg/ml)的培養(yǎng)液。2) 經(jīng)21-25 天后出現(xiàn)克隆細胞生長孔,首先在10 細胞/孔的板上出現(xiàn),當在1 細胞/孔的板上出現(xiàn)克隆生長時,即可將5 細胞/孔和10 細胞/孔的兩塊板丟棄。
3) 當0.5 細胞/孔和1 細胞/孔兩板上長出的細胞克隆變大時,將該孔的100μl 培養(yǎng)液懸浮混勻,分裝于96 孔板2 個孔內(nèi),50μl/孔,而且每孔已預先加有上述飼養(yǎng)細胞(50000/孔)。
4) 隨著細胞的繼續(xù)生長,用同法可將同一克隆細胞分裝擴充為4 孔,當分裝成8 孔時,可匯總這8 孔的細胞轉(zhuǎn)移至24 孔板的1 孔內(nèi)。
5) 細胞培養(yǎng)克隆可在如此條件下維持其生長,即每隔2-3 天更換含有IL-2(20u/ml)的新鮮培養(yǎng)液,每隔10-15 天更換含有新鮮飼養(yǎng)細胞、IL-2(20u/ml)和PHA(1μg/ml)的培養(yǎng)液,其中加入飼養(yǎng)細胞的比率應為T 細胞克隆細胞數(shù)0.5-1×106 細胞需106 飼養(yǎng)細胞。
鄰硝基*    *    500ku    
對硝基*    *    25ku    
鄰硝基苯胺    進口/國產(chǎn)    125ku    
對硝基苯胺    *    10u    2~8℃
間硝基苯胺    *    100u  
細胞培養(yǎng) 

 

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