在外周血中，要分離到足夠數(shù)量的細(xì)胞凋亡檢測(cè)，通常不用比重為1.077的細(xì)胞分層液，因?yàn)閱魏思?xì)胞的比重與淋巴細(xì)胞近似，且含量?jī)H為3%-8%，故很難將兩者分開。而如用黏附法，則黏附細(xì)胞的剝離較難控制，剝離過度易造成細(xì)胞損傷，剝離不全使細(xì)胞回收率下降。那有沒有什么方法可以分離單核細(xì)胞呢，小編整理了兩個(gè)方法一起來看下吧！

實(shí)驗(yàn)原理

PBMC的密度與血液中的其他成分不同。紅細(xì)胞和粒細(xì)胞的密度較大，為1.092左右；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的密度為1.076～1.090；血小板為1.030～1.035。因此，利用一種密度介于1.076～1.090之間、近于等滲的溶液(分層液)進(jìn)行密度梯度離心，可使不同類別的血細(xì)胞按其相應(yīng)密度分布，從而被分離。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 聚蔗糖-*分層液法

聚蔗糖-*(Ficoll-hypaque，F(xiàn)-H)分層液為密度梯度離心法常用的分離液，其主要成分是聚蔗糖和*。聚蔗糖 (Ficoll) 分子量為40kD，具有高密度、低滲透壓、無毒性的特點(diǎn)；常用的Ficoll溶液濃度為6%，密度為1.020。* (Hypaque) 用來增加密度，適量加入密度為1.200、濃度為34%的Hypaque于Ficoll溶液中，配成密度為1.077±0.001的分層液，稱為淋巴細(xì)胞分層液，用于淋巴細(xì)胞的分離。

分離細(xì)胞時(shí)，將肝素抗凝全血疊加在分層液上，使兩者形成一個(gè)清晰的界面。水平離心后，形成不同層次的液體和細(xì)胞區(qū)帶，從而分離出PBMC。紅細(xì)胞和粒細(xì)胞密度大于分層液，同時(shí)因紅細(xì)胞遇Ficoll而凝集成串錢狀，沉積于分層液底部；血小板因密度小而懸浮于血漿中；PBMC的密度稍低于分層液，故位于血漿層和分層液的界面中，呈白膜狀。吸出單個(gè)核細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用臺(tái)盼藍(lán)染色檢查細(xì)胞活力。

本法分離單個(gè)核細(xì)胞的純度可達(dá)95%，細(xì)胞獲得率達(dá)80%以上，細(xì)胞活性達(dá)95％以上小鼠淋巴細(xì)胞的比重與人淋巴細(xì)胞比重不同，若分離小鼠淋巴細(xì)胞應(yīng)選用小鼠淋巴細(xì)胞分離液，比重1.092±0.001。

2. Percoll分層液法

Percoll是經(jīng)過聚乙烯吡咯烷酮 (polyvinyl pyrolidone, PVP)處理的硅膠顆?；鞈乙?，對(duì)細(xì)胞無毒性和刺激性

Percoll混懸液的硅膠顆粒大小不一，經(jīng)過高速離心后，可形成一個(gè)連續(xù)密度梯度，將比重不同的細(xì)胞分離純化。

1) 將1份10XPBS與9份Percoll貯存液混合，制成等滲Percoll懸液，此懸液被認(rèn)為是Percoll懸液，其密度為1.1294g/ml。用PBS或細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋Percoll而獲得所需密度的Percoll分離液用于相應(yīng)細(xì)胞的分離。若分離淋巴細(xì)胞凋亡檢測(cè)應(yīng)使用1.0777g/ml，配制時(shí)用稀釋液稀釋60%即可。

2) 取比重1.077的Percoll分離液X ml與離心管中，將等倍稀釋的抗凝血1/2 X ml 小心疊加在分離液上，經(jīng)水平離心(1500rpm)后，便得四個(gè)細(xì)胞層，從而分離出淋巴細(xì)胞。表層為死細(xì)胞殘片和血小板，底層為粒細(xì)胞和紅細(xì)胞，中間有兩層，上層富含單核細(xì)胞，下層富含淋巴細(xì)胞。

3) 該法是純化淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的一種較好的方法，淋巴細(xì)胞純度高達(dá)98%，單核細(xì)胞純度可達(dá)78%。
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