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上海莼試生物技術有限公司
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重編程的細胞凋亡檢測分析

時間:2017-8-25閱讀:164
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通過轉錄因子的強制性表達,可使體細胞凋亡檢測重編程為多能狀態,這是一個動態的過程。一個體細胞如何成功地進行這一轉變,對此我們知之甚少,因為低效率、較長的潛伏時間和非同步進程會阻礙分子分析。隨時間推移描述大量細胞群的特征,讓我們對整個重編程細胞群的進程有了深刻認識,但經歷這個過程的大多數細胞不能重編程,對該過程的整體分析,必然偏向非生產性重編程事件的測量。
為了解決這些問題,研究團隊試圖識別和表征生產性重編程細胞群。轉基因化學計量的早期作用是從誘導多能干細胞(iPSCs)的轉基因整合位點推斷出的,通過依據轉基因表達水平分選纖維母細胞。Sox2low、Oct4high、Klf4high,被認為是一個組合,經過表達不同轉基因化學計量的多順反子構件得以進一步驗證。單細胞延時成像技術分析顯示一種早期的增殖表型。早期的工作揭示了重編程狀態的進程,連續獲得了多能性標志物堿性磷酸酶、SSEA1、Nanog和Oct4。此外,研究人員觀察到,成纖維細胞標記Thy1的抑制和逆轉錄病毒表達的缺失,發生在這個過程的早期。這些狀態的表征顯示,兩次重編程與c-Myc、Klf4介導的*次及Oct4、Sox2、Klf4介導的第二次同時出現。
穩定的部分重編程細胞系,已被分離并得以表征。這些部分重編程的細胞在該過程中出現較晚,但是在獲得多能性之前,可能來自于多個重編程細胞群,包括成纖維細胞、神經干細胞和B細胞。形態上它們類似于iPSCs,但沒有獲得多能性,因為它們不能形成畸胎瘤并依賴重編程轉基因。雖然這些細胞的大部分在標準條件下沒有獲得多能性,但是通過5-氮雜胞苷和*或過表達Nanog,可以把它們推向多能狀態,從而表明它們類似一個中間狀態,在這個狀態中有障礙抑制了多能性的獲得。
雖然豐富中間體的表征一直是有用的,但分析仍然高度依賴批量細胞群,因為大細胞群的異質性仍然是普遍的。近,有研究人員試圖通過單細胞mRNA分析,鑒定重編程的早期隨機階段,隨后是與SOX2表達對應的晚期確定性階段,來解決這一問題。盡管這項研究的結果很重要,但是其結論可能因在每個時間點測定的樣本數相對較小所限制(96個細胞),此外還因為較低的重編程效率,只有2%的細胞可以成功地重新編程。為此,在這項新的研究中,斯坦福研究小組通過單細胞質譜流式細胞技術(一種流式細胞儀技術,采用稀土金屬同位素標記抗體和檢測)來表征重編程過程。細胞凋亡檢測技術產生的結果,與傳統的熒光流式細胞術基本相同,但可讓我們每秒鐘在大約500個細胞中同時測量40多種不同的參數。使用質譜流式細胞技術,該研究小組在重編程的*個3到4周,分析了三個不同的重編程細胞系。對質譜流式細胞技術數據集進行的時間分辨、高維進展分析,可促進連續的重編程分子圖譜的構建。本研究所描述的這種方法和數據集,為重編程優化和其他細胞重編程機制研究、以及隨時間動態變化的復雜細胞群研究,提供了寶貴的資源。
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細胞凋亡檢測

 

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