小鼠原代胃Cajal間質細胞操作要點

培養條件優化

1. 培養基選擇與補充： 建議使用DMEM/F12基礎培養基，添加10%胎牛血清（FBS），1%雙抗，以及以下關鍵生長因子：

干細胞因子（SCF，50ng/ml）： 促進ICC存活和增殖。

胰島素樣生長因子-1（IGF-1，25ng/ml）： 增強細胞代謝活性。

肝細胞生長因子（HGF，10ng/ml）： 維持ICC表型，抑制分化。

2. 培養環境： 將細胞置于37℃、5% CO2的恒溫培養箱中，保持濕度飽和。由于ICC對氧化應激敏感，建議在培養箱中維持低氧條件（5% O2），以模擬其體內微環境。

3. 換液頻率：換液應在接種后24小時進行，以去除未貼壁的細胞碎片。之后每2-3天換液一次，換液時保留約1/3舊培養基，以維持細胞分泌的自分泌因子。

細胞鑒定與功能檢測

1. 免疫熒光鑒定：使用特異性抗體標記ICC的標志物，如c-Kit（CD117）、ANO1（TMEM16A）和vimentin。建議進行共標實驗，例如c-Kit/ANO1雙標，以提高鑒定準確性。

2. 電生理特性檢測： 采用膜片鉗技術記錄ICC的自發電活動，觀察其起搏電流（如：周期性內向電流）和慢波電位，這是ICC功能的重要指標。

3. 鈣成像： 使用Fluo-4 AM等鈣離子熒光探針，檢測ICC內鈣振蕩的頻率和幅度，評估其鈣信號傳導功能。

常見問題與解決方案

細胞貼壁率低：檢查膠原蛋白包被是否均勻，嘗試增加包被時間（4℃過夜）。亦可使用纖維連接蛋白（fibronectin）輔助包被。

細胞增殖緩慢： 確認生長因子活性，建議分裝保存避免反復凍融。檢查血清批次，必要時更換優質血清。

細胞表型丟失： 避免過度傳代（建議P3以內），縮短消化時間，并定期進行免疫熒光鑒定。

注意事項

無菌操作： ICC培養對無菌要求高，所有操作需在超凈臺內完成，試劑需經0.22μm濾膜過濾。

輕柔操作： ICC細胞膜脆弱，吹打時避免產生氣泡，建議使用寬口吸頭。

數據記錄： 詳細記錄細胞形態、增殖狀態和實驗參數，便于追溯問題。