實時熒光定量PCR:
實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限,實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品Ct值的計算,根據標準曲線獲得定量結果。因此,實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的:
1)Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時,剛剛進入真正的指數擴增期(對數期),此時微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現性,即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數存在線性關系,可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定,因此,實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
外標準曲線的定量方法相比內標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確,重現性*定量方法,已得到的*,廣泛用于基因表達研究、轉基因研究,藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。?
參數規格:
產品名稱:植物內源基因tRNA-Leu核酸檢測試劑盒
產品規格:50T
產品貨號:FS-P10546
產品分類:熒光PCR法
產品運輸:低溫運輸
儲存條件:-20℃避光保存,避免反復凍融。
運輸:低溫、避光,快遞免費送貨上門。
產品特點:
本產品就是根據保守區設計引物而開發的高靈敏 PCR檢測試劑盒 。
實驗過程:
一、試劑準備
1. DNA模板
2.對應目的基因的特異引物(在PCR反應中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制,而不能從無到有,憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物。可以是DNA也可以是RNA,一般20多bp,需要根據你的模板鏈設計。因此,擴增不同的基因需要設計不同的引物)
3.10×PCR Buffer
4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5.Taq酶
二、操作步驟
1.在冰浴中,按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1(10pM) 2μl
引物2(10PM) 2μl
Taq酶(2U/μl) 1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。
2.調整好反應程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執行擴增。一般:在93℃預變性3-5min,進入循環擴增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環30-35次,zui后在72℃ 保溫7min。
3.結束反應,PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4.PCR的電泳檢測:如在反應管中加有石蠟油,需用100μlLuFang進行抽提反應混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。
定量PCR方法:
a、競爭法
選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增(其中一個引物為熒光標記)。擴增后用內切酶消化PCR產物,競爭性模板的產物被酶解為兩個片段,而待測模板不被酶切,可通過電泳或高效液相將兩種產物分開,分別測定熒光強度,根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數。
b、內參照法
在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物,內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記,下游引物不標記。在模板擴增的同時,內標也被擴增。在PCR產物中,由于內標與靶模板的長度不同,二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來,分別測定其熒光強度,以內標為對照定量待檢測模板。
c、PCR-ELISA法
利用di高辛或生物素等標記引物,擴增產物被固相板上特異的探針所結合,再加入抗di高辛或生物素酶標抗體-辣根過氧化物酶結合物,最終酶使底物顯色。常規的PCR-ELISA法只是定性實驗,若加入內標,作出標準曲線,也可實現定量檢測目的。
PCR的反應條件:
因擴增片段的大小、反應體積、使用擴增儀器的不同而不同。
◇ 循環次數
根據模板DNA的量以及擴增片段的大小,設定25~30個循環。
如果循環次數太少,擴增量不足;如果循環次數太多,則會出現Smear。
◇ Anneal以及Extension
合適的Anneal溫度通常在45~68℃之間 (預備實驗可2℃間隔進行)。另外,由于在60~68℃間,也有很高的活性, 因此可在此溫度范圍內設定Anneal-Extension溫度, 進行2 Step PCR。Anneal-Extension溫度為68℃ 時,每kbp大體可設定30秒~1分鐘;當溫度設定在68℃以下時, 時間設定可稍長一些。通常,Anneal溫度太高,有時會得不到擴增產物;Anneal溫度太低時,容易發生非特異性反應。另外,Extension時間太短時,會得不到擴增產物或者會有一些短的非特異性產物優成;而Extension時間太長時,會出現Smear。
紫色鏈霉菌琥珀變種生長條件: 28℃培養基: 0012提供形式: 凍干物安全等級: 1模式菌株: no 液氮超低溫凍結法;真空冷凍干燥法
海綿假單胞菌培養基: 472潛在的有機污染物降解菌/分離自石油富集菌群水樣/上層海水提供形式: 凍干物模式菌株: no生長條件: 25℃ 液氮超低溫凍結法;-80℃冰箱凍結法;真空冷凍干燥法
-875℃冰箱凍結;真空冷凍干燥
鏈霉菌屬培養基: CM0038活性物質,Xa因子抑制活性提供形式: 斜面培養物安全等級: 1模式菌株: no生長條件: 28C -80℃冰箱凍結
慢生大豆根瘤菌生長條件: 28-30℃培養基: 0053提供形式: 凍干物安全等級: 1模式菌株: no 真空冷凍干燥法;礦物油法;定期移植法
黑木耳培養基: CM0017用于食用菌。提供形式: 斜面培養物安全等級: 1模式菌株: no生長條件: 25~27℃ 礦物油法
弗雷德里克斯堡假單胞菌生長條件: 20℃培養基: 848土壤提供形式: 凍干物模式菌株: no 真空冷凍干燥法
嗜熱鏈球菌生長條件: 42℃培養基: 6提供形式: 凍干物安全等級: 1模式菌株: no 定期移植法
地中海擬無枝菌土壤微生物資源調查及分類學研究模式菌株: no土壤提供形式: 凍干物安全等級: 1培養基: 15生長條件: 28℃
-876℃冰箱凍結;真空冷凍干燥
裂殖酵母教學模式菌株: no土壤提供形式: 斜面培養物安全等級: 1培養基: 13生長條件: 25-28℃
GIM4.13=CGMCC4.645培養基: 0012模式菌株: no種屬: Streptomyces│glaucus提供形式: 斜面培養物安全等級: 1生長條件: 28℃ -80℃冰箱凍結法;真空冷凍干燥法
鄂霍次克海嗜冷桿菌深海細菌模式菌株: no水樣/表層海水提供形式: 斜面培養物安全等級: 1培養基: 471生長條件: 28℃
鏈霉菌培養基: 0012模式菌株: no淤泥提供形式: 凍干物安全等級: 1生長條件: 28℃ 液氮超低溫凍結法;真空冷凍干燥法
雙胞鐮孢 液氮超低溫凍結法;真空冷凍干燥法生長條件: 25-28℃提供形式: 凍干物模式菌株: no培養基: 0014
釀酒酵母培養基: CM0077發酵制面包。提供形式: 凍干物安全等級: 1模式菌株: no生長條件: 28-30℃ 真空冷凍干燥法
6--2-巰基并噻唑 2-二-叔丁基磷-2'-甲基聯 2-甲基-3-呋喃硫醇
草鈷 2-二叔丁基磷-2-(N,N-二甲基)聯 二丙基二硫
5-甲基噻唑 2-(二叔丁基膦)聯 2,3-二乙基吡嗪
1-乙基-4- 2-(二叔丁基磷)-1,1'-聯 2-乙酰基-3,5-二甲基吡嗪
Rhodamine 123 羅丹明 123 62669-70-9
Tellurium tetrachloride 四化碲 10026-07-0
Cyanuric fluoride 三聚 675-14-9
Octaphenylsilsesquioxane 八基-POSS 5256-79-1
大鼠正五聚蛋白3(PTX3)ELISA試劑盒 ,英文名: PTX3 ELISA Kit
The cat p27 core aigen (P27) ELISA Kit 貓p27核心抗原(P27)ELISA試劑盒
MouseIerleukin11,IL-11ELISAKIT 小鼠白介素11(IL-11)ELISA試劑盒 96T/48T 進口分裝
CLIAKitforHumanglycosylatedserumprotein,GSPELISAKit人糖化蛋白規格:48T/96T
無內素小量質粒抽提試劑盒20/50次
ELISAKitT4大鼠甲狀腺素規格:48T/96T
植物內源基因tRNA-Leu核酸檢測試劑盒朝藿定C110642-44-9中文別名:羊藿苷C;寶藿苷VI
英文名:Epmedin C
登錄號:110642-44-9
分子式:C39H50O19
分子量:822.80
分子結構:
外觀:淡黃色方晶
規格:20mg/支
純度:≥ 98%
用途:用于含量測定/鑒定/藥理實驗等。
提取來源:小檗科植物心葉羊藿Epimedium brevicornum Maxim.的干燥地上部分。
熔點:179-180℃
藥理藥效:具有抗骨質疏松、抗癌、免疫增強等廣泛的藥理作用。
貯存條件: 4℃冷藏、密封、避光
有效期: 2年