細(xì)胞的凍存方法與操作步驟及注意事項(xiàng)！

細(xì)胞的凍存方法與操作步驟及注意事項(xiàng)！

細(xì)胞越來越受廣大科研者的喜愛，但細(xì)胞不像人們想象中那么強(qiáng)大，在培養(yǎng)復(fù)蘇等過程中稍有不慎就不可能導(dǎo)致它的死亡。而且它必須是是在無污染的條件下培養(yǎng)，復(fù)蘇才能保證實(shí)驗(yàn)效果。在此百歐博偉公司技術(shù)為您詳細(xì)總結(jié)細(xì)胞的正確冷凍保存方法、保存詳細(xì)步驟，相關(guān)注意事項(xiàng)如下：

一、保存方法（主要有兩個(gè)）：

（1）傳統(tǒng)方法：冷存管置于4℃10分鐘→ -20℃30分鐘→ -80℃16～18小時(shí)（或隔夜）→液氮槽vaporphase*儲(chǔ)存。-20℃不可超過1小時(shí)，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

（2）程序降溫：利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以-1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase*儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。

二、步驟：

（1）冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情形。

（2）配制冷凍保存溶液（使用前配制）：將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中，*后濃度為5～10％，混合均勻，置于室溫下待用。

（3）依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液（約0.1ml）計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。

（4）離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細(xì)胞濃度為1～5×106cells/ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示*之冷凍保存管中，1ml/vial，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè)。

三、注意事項(xiàng)：

（1）欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好（logphase）且存活率高之狀態(tài)，約為80–90％致密度。細(xì)胞凍存前應(yīng)保證細(xì)胞的活力好，無污染

（2）冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否仍保有其*性質(zhì)，例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測(cè)試是否有抗體之產(chǎn)生。

（3）一定要保證DMSO的濃度是10%，凍細(xì)胞要舍得用進(jìn)口的DMSO

（4）注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，無菌且無色（以0.22micron　FGLP　flon過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650），以5～10ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因*儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。

（5）慢凍,快解凍。細(xì)胞在 -15 度左右胞內(nèi)形成結(jié)晶對(duì)細(xì)胞損傷，緩慢降溫有助于減少損傷，故放入 -20 度冰箱中凍存可實(shí)現(xiàn)緩慢降溫較為方便，保存時(shí)間過久會(huì)影響細(xì)胞活力。

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