細胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1）準備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640：GIBCO，貨號21875-091)，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲存。

二．細胞處理：

1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

產(chǎn)品屬于：

產(chǎn)品名稱：DMEM基礎培養(yǎng)基    

英文名稱：DMEM

貨號：FS-01X9983

產(chǎn)品規(guī)格：500ml   

細胞培養(yǎng)的優(yōu)點：

注意事項：

 Interferon Regulatory Factor 4 (IRF4)干擾調(diào)節(jié)因子4(IRF4)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Transglutaminase 3, Epidermal (TGM3)表皮轉(zhuǎn)(TGM3)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Fascin (FSCN)肌動蛋白束蛋白(FSCN)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Ribonuclease A3 (RNASE3)核糖核A3(RNASE3)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Hydroxymethylglutaryl Coenzyme A Synthase (HMGCS)羥甲基戊二酰輔A合(HMGCS)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Regenerating Islet Derived Protein 1 Alpha (REG1a)胰腺再生蛋白Iα(REG1α)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Oncostatin M Receptor (OSMR)抑瘤M受體(OSMR)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Inhibin Beta B (INHbB)抑制βB(INHβB)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Cytochrome b-561 (CYB561)細胞色b-561(CYB561)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Major Vault Protein (MVP)主要穹窿蛋白(MVP)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Calumenin (CALU)鈣腔蛋白(CALU)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Amylase Alpha (Amya)淀粉α(Amyα)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Interleukin 2 Receptor Alpha (IL2Ra)白介2受體α(IL2Rα)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Cholinergic Receptor, Muscarinic 3 (CHRM3)毒蕈堿型受體M3(CHRM3)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Small Breast Epithelial Mucin (SBEM)小乳腺表皮粘蛋白(SBEM)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 1-Desamino 8D Arginine Vasopressin (DDAVP)去精加壓(DDAVP)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Procollagen I N-Terminal Propeptide (PINP)Ⅰ型前膠原基端原(PⅠNP)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Cysteinyl Leukotriene Receptor 2 (CYSLTR2)半胱酰白三烯受體2(CYSLTR2)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T
DMEM基礎培養(yǎng)基ZSWIM3  ZSWIM3蛋白抗體規(guī)格: 0.2ml

ZNRF1  鋅指/環(huán)指蛋白1抗體規(guī)格: 0.2ml

ZNRF2  鋅指/環(huán)指蛋白2抗體規(guī)格: 0.2ml

ZNRF3  鋅指蛋白3/環(huán)指蛋白3抗體規(guī)格: 0.2ml

ZNRF4  鋅指/環(huán)指蛋白4抗體規(guī)格: 0.2ml

ZNF230/RNF141  鋅指蛋白230抗體規(guī)格: 0.2ml

UBR2  泛蛋白連接E3α2抗體規(guī)格: 0.2ml

UBOX5/RNF37  泛結合7相互作用蛋白5抗體規(guī)格: 0.2ml
實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。