【儀表網(wǎng) 研發(fā)快訊】核磁共振方法除可獲得分子結(jié)構(gòu)信息外，還可觀測分子的動態(tài)特性，這些可為闡明蛋白質(zhì)等生物大分子的功能機(jī)制提供重要信息。隨著高速魔角旋轉(zhuǎn)技術(shù)的發(fā)展，固體核磁譜分辨率大幅提高，從理論上突破了液體核磁觀測的分子量的限制，逐漸被運(yùn)用于研究磷脂膜環(huán)境中的膜蛋白等超大生物分子復(fù)合物體系的動態(tài)構(gòu)象。但低信號強(qiáng)度和低分辨率限制了生物分子固體核磁研究的廣泛開展。自然界中氫原子和氟原子的旋磁比大、NMR信號強(qiáng)，是比較理想的NMR觀測對象。氟原子在生物分子結(jié)構(gòu)中極少存在，無觀測背景信號，是理想的NMR觀測探針。因此，氫檢測和氟檢測方法的發(fā)展可能顯著擴(kuò)展固體核磁在復(fù)雜生物體系中的運(yùn)用。
 

　　2023年8月23日，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)微尺度物質(zhì)科學(xué)國家研究中心史朝為課題組在國際著名學(xué)術(shù)期刊ScienceAdvances上在線發(fā)表了題為“Fluoride permeation mechanism of the Fluc channel in liposomes revealed by solid-state NMR”的研究論文，研究團(tuán)隊以氟離子通道蛋白Fluc-Ec1作為研究對象，結(jié)合氘代和19F定點標(biāo)記方法，發(fā)展并優(yōu)化膜蛋白固體核磁氫檢測及氟檢測研究方案，為膜蛋白核磁研究提供新思路。
 

　　環(huán)境中的氟離子可通過弱酸積累效應(yīng)在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)積累，產(chǎn)生毒害作用。微生物通過F-膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將F-運(yùn)輸至體外進(jìn)而抑制其毒性作用。來自Fluc(fluoridechannel)家族的Fluc-Ec1蛋白是由130個左右的氨基酸組成的離子通道，具有獨特的雙重拓?fù)涠垠w的結(jié)構(gòu)，且對氟離子具有高度選擇性。靜態(tài)的F-通道蛋白的晶體結(jié)構(gòu)難以描述F-滲透的具體機(jī)制，F(xiàn)-通道蛋白被抗體類似物固定在一種構(gòu)象上。氟原子和氧原子相似的電子云密度以及分子動力學(xué)模擬數(shù)據(jù)使得晶體結(jié)構(gòu)中極性軌道(polartrack)上的氟離子結(jié)合位點(F1and F2sites)引發(fā)爭議，另外突變體功能保留或喪失的機(jī)制目前仍不清楚。
 

　　研究團(tuán)隊通過觀測磷脂膜環(huán)境中的Fluc-Ec1在不同氟離子濃度中的構(gòu)象，結(jié)合基因密碼子擴(kuò)展方法，在蛋白質(zhì)前庭位置引入非天然氨基酸三氟甲基苯丙氨酸(tfmF)，設(shè)計19F-19F自旋擴(kuò)散實驗，驗證了Fluc-Ec1存在新的氟離子結(jié)合位點(F0site)。研究團(tuán)隊利用1H-1H自旋擴(kuò)散實驗直接檢測水和蛋白質(zhì)的相互作用，通過氘代來減少氫原子的非相干背景，結(jié)合water-hNH譜圖以及自旋擴(kuò)散傳遞和衰減規(guī)律，得到了主鏈酰胺質(zhì)子和水分子的距離信息，證明了F1位點結(jié)合的是水，而不是氟。
 

　　此外，晶體學(xué)研究無法從結(jié)構(gòu)的角度解釋F80M突變體具有功能活性而F83M突變體喪失功能活性的現(xiàn)象，研究團(tuán)隊通過分別對比F80M、F83M和野生型蛋白脂質(zhì)體樣品的碳檢測譜圖，結(jié)合液體核磁共振技術(shù)驗證loop 1突變體功能，發(fā)現(xiàn)loop 1是F83M突變體喪失通道活性的重要因素，進(jìn)一步揭示了loop 1在F-滲透過程中的重要性。綜上，研究團(tuán)隊更正了先前推測的氟離子通道離子配位位點，提出氟-水交替“water-mediated knock-on”的滲透模型，為全面理解Fluc通道中的滲透和門控機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。
 

　　中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)張瑾、宋丹、李娟以及德國亞琛工業(yè)大學(xué)的Florian Karl Schackert為該論文的共同第一作者，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)微尺度物質(zhì)科學(xué)國家研究中心史朝為特任研究員為該文章的通訊作者。中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)的龔為民教授、田長麟教授、項晟祺教授以及德國Jülich研究中心的Paolo Carloni和Mercedes Alfonso-Prieto教授團(tuán)隊也參與了該研究工作并給予了大力幫助。該研究得到了科技部、國家自然科學(xué)基金、中國科學(xué)院、中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)以及德國科學(xué)基金會的經(jīng)費(fèi)資助?！?合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國家研究中心、科研部)